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      Bio-techne|選好對照,給實驗上道保險

      當我們歷經種種挑戰獲得實驗結果,經常會發出疑問三連:

      • 我的實驗結果是不是準確?
      • 我的結果是否出現假陽性或假陰性?
      • 結果的差異是不是因實驗設計中的變量造成的?

      要回答這些問題,合適的對照樣品就成了不可或缺的一環。

       

      一、陰性對照與陽性對照

      • Western Blot 實驗結果有雜帶?
      • IHC 實驗沒有陽性信號?
      • 目的蛋白表達定位與文獻報道的有出入怎么辦?

      要回答這些問題,就需要在實驗中設置陰性或陽性對照。

      陽性對照品一般會使用文獻或數據庫中報道的高表達目的蛋白的組織或細胞。陽性對照確保了實驗的靈敏度,也保證了實驗過程中抗原抗體的結合效率。

      陰性對照品一般會使用或文獻或數據庫中報道的低表達目的蛋白的組織或細胞,使用敲低或敲除目的基因的樣本。在 IHC/ICC 實驗中,也可以用 PBS 或同型對照代替一抗。陰性對照確保了實驗的特異性,排除非特異性信號對結果造成的干擾。

       

      接下來,我們舉個例子:

      比如用二乙基亞硝胺誘導小鼠肝纖維化,常常用 Alpha-SMA 作為肝纖維化的標志物。在進行 IHC 實驗時,為了保證陽性信號的可靠性,就需要平行加一個胃或結腸組織的樣本作為對照。因為,Alpha-SMA 會特異性的表達在平滑肌細胞,而黏膜細胞無表達。

      圖片來源:W Li et al. Cell Death Dis (2019).

      如上圖的所示,胃平滑肌層陽性信號明顯,黏膜層無陽性信號,證明抗體得到的信號是敏感且特異的(Alpha-SMA,貨號 NBP2-33006)。

       

      二、同型對照

      這個概念,相信深諳流式細胞技術的小伙伴都耳熟能詳。因為抗體本身的特殊功能,特別是抗體 IgG Fc 段與細胞的 Fc 受體結合的能力,會使實驗結果的非特異性信號加強。

      同時,在一些抗體的功能性實驗,比如中和實驗和封閉實驗中,也會對細胞(尤其是免疫細胞)的生理功能產生一定的影響,進而導致實驗結果與預期或文獻報道不相符。

      抗體結構與抗體類型示意圖

      這時,同型對照就是必不可少的工具:

      同型對照是陰性對照的一種,是利用與實驗抗體同亞型的免疫球蛋白,排除實驗本底信號的工具。廣泛運用在免疫組化、免疫熒光、流式細胞術、抗體封閉中和實驗等一些以抗原-抗體結合為基礎的實驗中。

      同型對照需要選用與目標抗體相同種屬來源、相同的免疫球蛋白類型及亞型的抗體。如果是應用在流式細胞術,還需要標記相同的熒光素。我們通常建議選用來自與特異熒光抗體相同生產廠家的同型對照抗體, 因為其生產工藝、熒光蛋白比值以及標記工藝都是相同的。

      比如:

      用  Mouse Anti-Human MICA PE-conjugated Monoclonal Antibody(貨號 FAB1300P)檢測 K562  細胞表面的 MICA,因為該抗體的種屬來源是小鼠,免疫球蛋白是 IgG,亞型是 2B,標記的熒光素是 PE,所以,我們使用的同型對照應該是 Mouse IgG2B PE 抗體(貨號 IC0041P)。

      如上圖,左邊藍色的峰為同型對照,右邊橙色的峰為 MICA 特異性的 PE 信號峰。有了同型對照,自然就能分辨出合適的陽性熒光強度,為之后設門和進一步分析打下可靠的基礎。

      設置合適的對照就像給實驗加上一層保險,保證了實驗結果的可靠性,也為后續實驗的優化及 trouble shooting 提供了重要的線索。

       

      以上文字和圖片來源于Bio-techne

       

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